單細胞與空間組學中心實驗室

10X Chromium Next GEM 單細胞 3’ 基因表達工作流程

Chromium Next GEM 芯片:

• 每塊芯片最多可並行處理 8 個樣本
• 每通道 500 至 10,000 個細胞
• 每塊芯片運行時間 18 分鐘
• 優選細胞大小 < 30 µm
• 細胞回收率約 60-65%

單細胞RNA測序（scRNA-Seq）文庫製備採用基於PIPseq技術的無微流控工作流程。這些試劑盒旨在實現便利性、可擴展性和生成高品質數據。

此試劑盒可捕獲mRNA轉錄本的3'端，並相容於多種樣本類型，包括血液、骨髓以及來自人類、小鼠、酵母和斑馬魚的單細胞樣本，每個樣本的細胞數量範圍為2,000至100,000個。

此工作流程簡單易行，可在實驗台上操作，無需昂貴的微流控設備，並可靈活設定操作步驟。該流程包括使用顆粒模板即時分區（PIPs）進行細胞捕獲和條碼標記，隨後進行cDNA合成和文庫建構以進行測序。

1. 細胞捕獲和裂解

• 混合：將單細胞或細胞核懸浮液與條碼水凝膠模板顆粒 (PIP) 和油混合。
• 乳化：使用特殊渦旋混合器將混合物乳化，形成數百萬個隔間，每個隔間可能包含一個細胞和一個條碼磁珠。
• 裂解：在隔間中裂解細胞以釋放 mRNA，mRNA 隨後與條碼磁珠上的 poly(dT) 引子結合。

2. cDNA 合成

• 脂質體破裂：化學破裂脂質體並洗滌以回收磁珠。
• 逆轉錄：磁珠進行批量逆轉錄，產生包含獨特細胞條碼和固有分子標識符 (IMI) 的全長 cDNA。

3. 文庫構建

• 片段化和標記：將 cDNA 片段化，並連接接頭以相容測序。
• 擴增：透過 PCR 擴增文庫，以確保測序所需的足夠濃度。

4. 測序和分析

• 測序：使用雙端測序技術，在相容的 Illumina 平台（例如 NextSeq 2000、NovaSeq X）上對文庫進行測序。
• 數據分析：使用 DRAGEN 二級分析軟件處理測序數據，進行細胞計數和基因表現譜分析。

• 時間：總長度約 15 小時（細胞捕獲需 10 分鐘）。
• 可擴展性：每個樣本可處理 100個至 20 萬個細胞。
• 相容性：適用於新鮮細胞或固定細胞（DSP/甲醇固定）。
• 設備：需要 Illumina 單細胞製備入門設備，其中包括專用渦旋混合器和用於精確處理脂質體的乾式浴槽。

對冷凍保存的人類週邊血單核細胞 (PBMC) 進行單細胞 RNA 測序 (scRNA-Seq)。使用 Illumina Single Cell 3ʹ RNA Prep T20 試劑盒捕獲的 31,613 個細胞的 UMAP 分析，能夠區分不同的免疫細胞群。

利用單細胞RNA測序技術對冷凍小鼠腦組織中的細胞核進行測序。使用T100試劑盒捕獲的155,000個細胞核進行UMAP分析，解析出不同的腦細胞群。